详细信息Tunel法HRP—Roche公司产品
§ 原理:Tunel即末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TdT-mediatedX-dUTP nick end labeling)法,细胞凋亡时双链DNA会出现许多不对称的断裂点,暴露出3’-OH,末端转移酶(TDT)可催化地G(高)辛、生物素或荧光素等标记的脱氧核苷酸加到3’-OH末端,再通过免疫组化方法进行检测,可以观察凋亡细胞的形态,染色定位及组织中的分布。Tunel法可用于细胞悬液,石蜡/冰冻切片和细胞涂片等多种样本的检测 二、试剂组成:In Situ Cell Death Detection Kit(FITC标记--HRP),Cat#:11684817910。1、酶溶液—TDT酶(末端转移酶)5×50ul;2、标记溶液[FITC-11-dUTP 10×反应混合液(内含:1mM dATP, 1mM dCTP, 1mM dGTP,0.65mMdTTP, 0.35mM b-Dutp pH6.5)] 5×550ul;3、检测试剂(抗FITC-HRP既用型 3.5ml) 三、操作流程 大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞 即PC-12 细胞爬片检Tunel 1、细胞片 ⑴培养细胞贴壁培养,4%多聚甲醛固定10-20min,蒸馏水洗,0.01mol/L pH7.3 PBS 洗3×3min; ⑵ 穿孔:0.1%Triton X-100/PBS 洗5-10min,20ug/L proteinase K 消化 5min ,室温,蒸馏水洗5minX2, PBS 洗3×3min; ⑶Tunel混合液的准备 50ul TDT +450ul标记缓冲液 ⑷滴加50ul/片Tunel混合液 湿盒中 37℃ 1h ;(此步需避光) ⑸0.01mol/L pH7.3 PBS 洗3×3min; ⑹滴加50ul/片抗FITC-HRP 二抗 湿盒中 37℃ 30min; ⑺0.01mol/L pH7.3 PBS 洗3×3min; ⑻.0.04% DAB+0.03%H2O2显色10min,水洗 ⑼苏木素衬染1min, 水洗蓝化 系列乙醇脱水 ⑽吹干后常规树胶封片。 2、石蜡切片 ⑴ 4 μm石蜡切片常规脱蜡至水, ⑵ PBS洗 3×3min ⑶ 3%H2O2处理, 20min, 室温 ⑷蛋白酶K 20μg/ml 10-20min 37℃ ⑸0.1%Triton X-100/PBS 洗5-10min ⑹ PBS洗 3×3min ⑺Tunel混合液的准备 50ul TDT +450ul标记缓冲液 ⑻30μl/每片 湿盒中 37℃ 1h ;(此步需避光) ⑼PBS洗 3×3min ⑽滴加50ul/片抗FITC-HRP 二抗 湿盒中 37℃ 30min; ⑾0.01mol/L pH7.3 PBS 洗3×3min; ⑿ 0.04% DAB+0.03%H2O2显色10min,水洗 ⒀苏木素衬染1min, 水洗蓝化 系列乙醇脱水 ⒁吹干后常规树胶封片。 四、观察:凋亡指数(apoptosis index,AI)在普通光镜下连续观察10个高倍视野计数阳性细胞数,换祘为平均每平方毫米的凋亡细胞数,即为AI。
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